汉坦病毒IgG抗体（HV-IgG） ELISA检测试剂盒工作原理

检测原理

试剂盒采用双抗一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被汉坦病毒抗原微孔中，依次加入标本、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中汉坦病毒IgG抗体（HV-IgG）的存在与否。

样品收集、处理及保存方法

1.  血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.  血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.  细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.  组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5.  保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

操作注意事项

1.  试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2.  实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3.  预处理后的样本无需稀释，直接取50μL加样即可。

4.  严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5.  所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成

试剂的准备

 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

洗板方法

1.  手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。

2.  自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步骤

1.  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.  设置阴、阳性对照孔和样本孔，阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照各50μL；

3.  待测样本孔加待测样本50μL；

4.  随后阴、阳性对照孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入终止液100μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

 1.  试验有效性：阳性对照孔OD值平均值≥1.00；

                阴性对照孔OD值平均值≤0.15。

2.  临界值（Cut off）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15

3.  阴性判断：样品OD值＜临界值（Cut off），样品为阴性

4.  阳性判断：样品OD值＞临界值（Cut off），样品为阳性

试剂盒性能

1.  准确性：阳性对照孔OD值平均值≥1.00；阴性对照孔OD值平均值≤0.15，说明试验结果有效。

2.  特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

3.  重复性：板内、板间变异系数均小于15%。

4.  贮藏：2-8℃，避光防潮保存。

5.  有效期：6个月

免责声明

1.   试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。

  严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。