关于ELISA样本的收集问题

关于ELISA样本的收集

一般来说，由于ELISA实验只能检测可溶性蛋白质的含量，因此要求样本应清晰透明并离心除去沉淀物或悬浮物质。为确保实验的准确性， -20℃或-80℃保存的样本应在1-6个月内完成检测，4℃保存的样本在一周内完成检测。此外，样本中不能含有会抑制HRP活性的NaN3，否则会造成假阴性结果。

可用于ELISA实验的样本一般有血清、血浆、尿液、细胞培养上清以及组织匀浆等。不同样本类型的预处理方法也不同。适当的样本预处理是确保ELISA实验正确性和准确性的第一步。这里，我们将介绍几种不同样本类型的处理方法。

一、液体样本

液体样本处理原则：所有的液体样本，用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分）

1、血清：血清是ELISA实验最常用的样本，其预处理也十分简单。使用无热原无内毒素的试管或离心管采集血液样本，，将试管或离心管在室内温度下放置自然凝固（视室温环境10分钟到2小时不等）或4℃过夜，分离出血清，（建议倾斜试管或离心管以扩大液面的横截面，使血清能更大程度的分离出来，），2-6℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，立即进行测定，建议在-20℃或-80℃下将收集的血清分装保存，避免反复冻融，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

注意事项：在收集血液样本的过程中应避免溶血，因为红细胞在溶解时会释放具有过氧化物酶活性的物质，这种情况下，ELISA实验中将会出现非特异性显色反应，导致检测结果不准确，出现假阳性结果。另外，样本还应避免细菌污染，因为细菌可能含有内源性HRP，也会导致检测结果不准确。

2、血浆：应根据标本的要求选择EDTA、肝素钠、枸橼酸纳或柠檬酸钠作为抗凝剂，使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本，采集后30分钟内，混合10-20分钟后，2-6℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清液（血浆），建议在-20℃或-80℃下将收集的血清分装保存，避免反复冻融。样本应避免溶血或高血脂。保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

注意事项：检测前请仔细阅读ELISA试剂盒说明书，查看该试剂盒针对抗凝剂是否有特殊要求。

3、尿液：用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

4、细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。将细胞培养上清液吸入离心管中并以2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），除去细胞碎片和杂质，收集上清液备用，样本保存在-20℃或-80℃，避免反复冻融，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5、脑脊液：用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。(（采集大鼠脑脊液）的方法：采集脑脊液时，用湿纱布擦试大鼠颈背部皮肤，剪去背毛暴露皮肤。两耳连线剪一横切口(1. 5cm左右)，在其中点向尾侧沿皮下剪开2cm，将皮分离两侧，扩大视野。紧贴大鼠头骨依次逐层剪切各肌层，并断端依次拉向尾侧扩大视野。注意，有出血时用干纱布按压止血，保持术口清晰。接近颈后黄韧带时，小心地用7号注射针头分离附盖的肌肉，暴露寰枕膜。用1ml注射器(针头用止血钳使针尖与针体成150度钝角)，针斜面向上，针尖端近水平刺入蛛网膜下腔，固定针体，缓慢抽取脑脊液，一般采集量为100-200微升。)

6、唾液：用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

二、固体样本

固体样本处理原则：称取1g的固体样本，用9g的合适缓冲液溶解，分泌蛋白可以直接离心取上清检测，细胞内的蛋白，要先收集细胞，再用合适方法破碎，离心取上清测试。

1、组织标本：切割标本后，称取1g组织，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清。分装一份待检测，其余冷冻备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。对于植物组织，不好匀浆的话，就在液氮中充分研磨。

2、细胞内蛋白样本

许多待测蛋白不是分泌蛋白，而是存在于细胞内的蛋白，这个时候，要先收集细胞，洗涤干净，再破碎细胞，离心取上清。

（1）培养的细胞

A、动物细胞：用PH7.2-7.4的PBS稀释细胞悬液，使细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融（如果反复冻融，破碎效果不好，就采用超声波破碎），以使细胞破坏并放出细胞内成份。2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

B、植物细胞：用PH7.2-7.4的PBS稀释细胞悬液，使细胞浓度达到100万/ml左右，置于冰盒上，用超声破碎仪，设置破碎2s，冷却30s的方式，充分破碎细胞，以使细胞破坏并放出细胞内成份。2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

（2）组织的细胞

切割标本后，称取1g组织，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），去除上清，再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗涤沉淀的细胞三遍。再用上述的细胞破碎方法破碎细胞。

细胞反复冻融方法

1） 吸出培养板中的培养基，用胰蛋白酶消化细胞，然后加入适量的培养基将培养板上的细胞冲洗干净。悬浮细胞可以省略该步骤。

2） 将细胞悬浮液收集到离心管中，以1000×g离心10分钟，然后吸去培养基，用预冷PBS洗涤细胞3次。

3） 加入适量的预冷PBS（建议在使用前立即加入蛋白酶抑制剂）重悬细胞。在6孔培养板中，每个孔需要150-250μL的PBS来重悬细胞。

4） 使样本在-20℃或-80℃条件和室温条件下反复冻融，重复冻融过程数次，直至细胞完全裂解。也可以使用超声波细胞破碎器超声处理悬浮液来裂解细胞。

5） 4℃下以10,000×g离心10分钟，去除细胞碎片，收集上清液， -20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

3、土壤：称取1g土壤，加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS，用手工将标本充分混匀。2-8℃条件离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清。分装一份待检测，其余冷冻备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。如果是测分泌蛋白，直接取上清检测，测试细胞内蛋白，要破碎细胞。

三、植物

1、标本的精采集及保存

取0.1g（误差±3%以内）新鲜植物组织样本，在液氮中充分研磨；加入1ml的提取液（80%甲醇）, 置于-20℃过夜；于4℃，8000rpm，离心1小时，取上清；上清液过C-18固相萃取柱。具体步骤是： 80%甲醇（1ml）平衡柱→上样→收集样品→移开样品后用100%甲醇（5ml）洗柱→100%乙醚（5ml）洗柱→100%甲醇（5ml）洗柱→循环。过柱后的样本真空干燥或氮气吹干，保存备用；上样前加入pH7.4 PBS缓冲液（1ml定容）。混匀后室温放置30分钟，然后4℃离心（8000rpm，15分钟），取上清并暂时保存于4℃待用。

2、植物标本中相关酶或蛋白的测定：（粗提取）

新鲜植物组织请在液氮中充分研磨；加入样品体积9倍的提取液（pH 7.4 PBS缓冲液）,请于4℃，8000rpm，离心30分钟，取上清并暂时保存于4℃待用。

我们罗列的是通用的样本处理方法，无法涵盖各种样本，对于一些特殊样本，建议实验人员多参考已发表的文献，自行设计合理的样本处理方法。